Etude d'un complexe de régulation transcriptionnelle du gène d'un transporteur de glucose chez la Vigne (identification de gènes "ASR", analyse fonctionnelle de leurs regions promotrices et caractérisation moléculaire de ces protéines régulatrices)

Les protéines ASR sont impliquées dans les réponses aux stress abiotiques et beaucoup de processus de développement, comme la maturation. Cependant, leurs fonctions biologiques restent inconnues. L ADNc d une protéine ASR de Vigne, VvMSA, est isolée par l approche du simple hybride. Elle agit comme un facteur de transcription à l égard du promoteur du gène VvHT1. Le clonage du gène entier VvMSA révèle l existence d une famille multigénique d ASR, chez la Vigne. Une étude fonctionnelle de leurs promoteurs est réalisée par délétions des promoteurs et fusions en amont du gène rapporteur Luciférase par expression transitoire dans des protoplastes de Vigne. L expression conférée par les promoteurs VvMSA, est régulée par les sucres et induite par l ABA et le stress au froid. La caractérisation biochimique de VvMSA a montré la présence de 2 isoformes protéiques se différenciant par une délétion de 5 acides aminés provoquant une différence de mobilité électrophorétique. Des analyses in vitro et in vivo ont prouvé la phosphorylation des 2 isoformes de VvMSA. L hypothèse impliquant VvMSA dans un complexe de régulation transcriptionnelle est étudiée. Par une approche de double hybride, un partenaire protéique nommé VvDREB est isolé. La technique de BiFC a confirmé l interaction de VvMSA et de VvDREB et la formation exclusive de ce complexe dans le noyau. Les résultats obtenus montrent l implication des glucides, de l ABA et des stress abiotiques dans la régulation transcriptionnelle des gènes VvMSA. La caractérisation biochimique de VvMSA et son interaction avec VvDREB suggèrent leur intervention dans un complexe régulateur de l expression génique en réponse aux stress abiotiques.The ASR proteins are involved in plant response to abiotic stresses as well as in developmental processes such as ripening. However, biological functions of these proteins remain unknown. The one-hybrid approach allowed isolating, a grape ASR, VvMSA, witch is a putative transcription factor of VvHT1. In grapevine, cloning of VvMSA genes revealed one polymorphism in this multigenic family. The functional analysis of promoter regions is performed by progressive deletions and their fusion upstream to luciferase reporter gene. The constructions expression in grape protoplasts demonstrated a sugar regulation and ABA/cold stress induction of VvMSA expression. VvMSA Biochemical characterization showed two isoforms of the protein differing by a lack of five amino acids in one of them. In vitro and in vivo experimentation also revealed the phosphorylation of isoforms. VvMSA presents the functional characteristics of a regulatory protein, but does not display any domain specific for transcription factor. This suggests its involvement in a complex for transcriptional regulation. By the means of two-hybrid screening using VvMSA as bait, a partner of this protein is isolated. It is belonging to the DREB proteins family, involved in plant response to water, salt and osmotic stresses. By BiFC approach, we confirmed the interaction between VvMSA and VvDREB and provided the exclusive nuclear localization of their complex. The obtained results allow us to consider grape ASR as non-histone chromosomal proteins, that might act as downstream components of a common signal transduction pathway involved in the responses of plant cells to environmental factors mediated by sugar and ABA signaling.POITIERS-BU Sciences (861942102) / SudocSudocFranceF